INTRODUÇÃO

O sistema vascular apresenta características peculiares relacionadas à parede dos vasos, variando entre os de maior e menor calibre. Os vasos sangüíneos são compostos por tecidos particularmente ricos em matriz extracelular cujos componentes individuais, proteoglicanos, fibras dos sistemas elástico e colágeno, mudam como resultado de adaptações às exigências funcionais locais. Além disso, as artérias diferem funcional e estruturalmente das veias. É bem estabelecido que os dois principais tipos celulares dos vasos sangüíneos, as células endoteliais e as musculares lisas, sintetizam os proteoglicanos (1).

Nos últimos anos, a distribuição dos glicosaminoglicanos de vasos sangüíneos tem sido estudada particularmente na parede arterial, principalmente da aorta, devido ao seu envolvimento na patogênese da aterosclerose (2-8), hipertensão arterial (9) e diabetes (10-13).

Muitos são os dados na literatura sobre a distribuição e provável função dos glicosaminoglicanos em outras artérias elásticas ou musculares (6, 14-16). Por outro lado, poucos são os trabalhos que relatam a distribuição destes compostos em veias (14, 17, 18), e nenhum resultado sobre a análise comparativa da distribuição de glicosaminoglicanos em artérias e veias pode ser encontrado.

O conhecimento da distribuição destas macromoléculas nas diferentes veias e artérias é de considerável relevância, uma vez que a revascularização cirúrgica do miocárdio utiliza enxertos do próprio paciente, de segmentos de veias ou artérias. Dados da literatura mostram que um porcentual significativo destes enxertos será comprometido por lesões ateroscleróticas (19-26). Além disso, os enxertos venosos e arteriais diferem em relação à susceptibilidade à aterosclerose e, consequentemente, ao tempo de durabilidade do enxerto (27).

Os proteoglicanos arteriais são reconhecidamente fatores importantes no processo da aterosclerose tanto pela habilidade em seqüestrarem lipídeos para dentro da parede arterial, quanto pelo envolvimento nos processos de adesão, migração e proliferação celular (1, 28). Sabemos, também, que os diversos tipos de proteoglicanos têm diferentes e, muitas vezes, opostas funções.

O objetivo deste trabalho foi a análise comparativa da distribuição dos glicosaminoglicanos entre várias artérias e algumas veias de ratos, cães e humanos. Estas três espécies foram escolhidas para este propósito devido as suas, já conhecidas, diferenças no padrão de distribuição dos glicosaminoglicanos aórticos e susceptibilidade a aterosclerose (4).

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Casuística

Vasos sangüíneos humanos normais foram obtidos de necropsias (9 indivíduos de ambos os sexos, na quinta década de vida) e compreenderam: a aorta torácica e as artérias: carótida, subclávia e ilíaca, além das veia cava e ilíaca.

Os vasos obtidos de ratos adultos foram aorta e cava; artéria e veia ilíacas, e os obtidos de cães foram: aorta e cava, artéria e veia ilíacas, artéria femoral e veia safena, artéria e veia pulmonares, artéria carótida e veia jugular.

As amostras de aorta e da cava consistiram em segmentos torácicos e abdominais (com exceção de humanos). As artérias e veias ilíacas foram obtidas do segmento distal da ilíaca comum e do segmento proximal da ilíaca externa e interna. Somente as camadas média e íntima foram analisadas. A camada adventícia foi previamente dissecada e retirada dos vasos.

Foram utilizados os padrões de condroitim 4-sulfato, condroitim 6-sulfato, dermatam sulfato e heparam sulfato da Sigma Co Químico, St, Louis, Mo.

Tripsina (E.C. 3.4.4.4) de pâncreas bovino III, condroitinase AC-II (E.C. 4.2.5.5), extraída de Arthrobacter aurenscens, condroitinase ABC (E.C. 4.2.2.4.) extraída de Proteus vulgaris, e heparinase III ( E.C. 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum também foram adquiridas da Sigma Co Químico, St. Louis, Mo.

Agarose ("standard Low-Mr") foi adquirida da Bio Rad Laboratories (Richmond, CA, EUA).

MÉTODOS

Isolamento dos glicosaminoglicanos: As camadas média-íntima dos vasos sangüíneos foram cortadas em pedaços muito pequenos e deixadas por 48h a 5°C em acetona. Em seguida, o tecido livre de lipídeos neutros e substâncias liposolúveis foi obtido por centrifugação (2.000g, 30 min a 5°C) e o precipitado resultante (pó cetônico) seco à vácuo.

Os glicosaminoglicanos foram, então, extraídos por incubação de 10 mg de pó cetônico com 1 mg de tripsina em tampão Tris-HCl 0,05M, pH 8,0 como descrito por MARQUEZINI et al. (18) em 1995.

Os vasos obtidos de cães e humanos foram submetidos a extração individualmente, enquanto que os vasos obtidos de ratos, devido ao seu pequeno tamanho, foram processados em grupos com aproximadamente 9 espécimes de cada vaso sangüíneo.

Eletroforese em gel de agarose: cerca de 10 µg de glicosaminoglicanos foram aplicados em lâminas de gel de agarose a 0,5% em tampão 1,3-diaminopropano-acetato a 0,05M, pH 9,0. Após corrida eletroforética (120V por 1h), os glicosaminoglicanos foram precipitados no gel com 0,1% Cetavlon (brometo de N-acetyl-N, N, N-trimethylammonium) e corados com 0,1% azul de toluidina em ácido acético/etanol/água (0,1:5:5, v/v). A quantificação dos glicosaminoglicanos foi realizada por densitometria das lâminas de agarose coradas com azul de toluidina (29).

Ensaio enzimático: Amostras contendo cerca de 100 µg de glicosaminoglicanos foram incubadas com condroitinase AC-II (0,01U), condroitinase ABC (0,01U) ou heparinase III (0,01U) em tampão Tris-acetato 0,05M, pH 7,3, por 24h a 37°C (30°C para heparitinase III).

O tratamento com a condroitinase AC-II degrada os glicosaminoglicanos com migração eletroforética semelhante ao condroitim 4/6-sulfato padrão. Por outro lado, o tratamento com a condroitinase ABC degrada os glicosaminoglicanos com migração semelhante ao condroitim 4/6-sulfato e dermatam sulfato, enquanto que heparitinase III degrada somente os glicosaminoglicanos com migração semelhante ao padrão de heparam sulfato.

Cromatografia em papel: Após a digestão das amostras com as condroitinases ou heparinase III, estas foram aplicadas em papel "Whatman" n°1 e submetidas a cromatografia descendente em solvente ácido isobutírico/amônia (1M) (5:3, v/v) por 18h. Os dissacarídeos insaturados formados foram visibilizados por nitrato de prata e quantificados através de densitometria (30).

RESULTADOS

A eletroforese em gel de agarose dos extratos de glicosaminoglicanos obtidos da artéria e veia ilíacas de cão é mostrada na Figura 1. Uma banda foi obtida correspondente ao padrão de migração de dermatam sulfato. Este padrão foi observado para todos os vasos sangüíneos estudados, com exceção dos vasos humanos e aortas de cães, onde a banda eletroforética principal correspondeu ao padrão de migração de condroitim 4/6 sulfato padrão.



Da análise da quantidade relativa das unidades dissacarídicas obtidas da degradação de condroitim 4/6 sulfato pela condroitinase AC-II observamos que as unidades 6-sulfatadas ocorreram em maior concentração do que as unidades 4-sulfatadas para todas as artérias estudadas (Tabela 1).



Nenhuma tentativa foi feita para separar os condroitim 4 - e 6-sulfatos das veias. Estes compostos foram designados como condroitim sulfato e migraram como uma banda única neste sistema de eletroforese.

As porcentagens relativas de condroitim sulfato, dermatam sulfato e heparam sulfato obtidas por densitometria do gel de agarose, assim como a quantidade total destes glicosaminoglicanos são mostradas na Tabela 2.



As duas veias humanas estudadas, a cava e a ilíaca, classificadas como veias de grande calibre, apresentaram padrão idêntico em relação às quantidades relativas de glicosaminoglicanos, sendo dermatam sulfato o componente principal (93%) seguido por heparam sulfato (5%) e condroitim sulfato (£ 2%).

Nas artérias humanas (ilíacas, carótida e subclávia) dermatam sulfato também foi o principal glicosaminoglicano encontrado. A aorta, como já bem documentada (4), apresentou condroitim sulfato como o principal glicosaminoglicano obtido (93%).

Como podemos observar na Tabela 2, o padrão de distribuição dos glicosaminoglicanos foi semelhante para artérias e veias nas três espécies estudadas. Dermatam sulfato foi o principal glicosaminoglicano encontrado. Porém, as quantidades relativas de dermatam sulfato foram maiores nas veias quando comparadas com as artérias. Por exemplo, as artérias ilíacas de cães e ratos apresentaram 58% e 53% de dermatam sulfato, respectivamente, enquanto que as veias ilíacas correspondentes mostraram 82% e 76% de dermatam sulfato, respectivamente. Também pudemos observar que, em relação as artérias de rato, a porcentagem de heparam sulfato foi aproximadamente 20% maior quando comparada com os outros vasos sangüíneos dos demais animais analisados.

Os resultados apresentados mostraram que as artérias contêm maior quantidade de glicosaminoglicanos quando comparadas com as veias, e entre as artérias, a aorta apresentou as maiores concentrações (Tabela 2).

COMENTÁRIOS

Pela primeira vez foi demonstrado que dermatam sulfato é o glicosaminoglicano predominante tanto nas veias quanto nas artérias, exceto para a aorta de cães e humanos.

Os nossos dados mostrando a predominância de dermatam sulfato em veias estão de acordo com os relatos prévios de IZUKA & MURATA (17) que analisaram, em 1972, a veia cava humana (veia de grande calibre) e de MARQUEZINI et al. (18), que estudaram a veia safena humana (veia de médio calibre), em 1995.

Também pudemos demonstrar que há uma diferença significante entre a quantidade relativa de dermatam sulfato das artérias e suas veias correspondentes. As veias possuem maior concentração de dermatam sulfato. O significado funcional deste aumento não está claro. Sabemos, entretanto, que nas veias a pressão sangüínea é significantemente mais baixa e que elas exibem uma menor compressibilidade quando comparadas com as artérias.

O conhecimento da distribuição dos glicosaminoglicanos nas diferentes veias e artérias poderá trazer subsídios para o melhor entendimento do processo degenerativo vascular, tanto do sistema arterial, quanto das veias safenas quando empregadas na revascularização do miocárdio, assim como na prevenção da restenose. SCOTT et al. (27) demonstraram que 90% dos enxertos que utilizam a artéria torácica interna continuam funcionais por aproximadamente 10 anos. No entanto, 20% dos enxertos que utilizam a veia safena tornam-se inativos já nos primeiros anos após a operação e, aproximadamente, 45% estarão seriamente comprometidos nos próximos 10 anos.

A deposição e interação de lipoproteínas na matriz extracelular das artérias é sabidamente um evento crucial no desenvolvimento da aterosclerose. A parede arterial contém uma variedade de proteoglicanos. No entanto, trabalhos sobre a interação entre lipoproteínas e proteoglicanos em suínos (31) e humanos (32) mostraram que os proteoglicanos que interagem efetivamente com as lipoproteínas são aqueles que contêm dermatam sulfato na sua estrutura.

Os trabalhos de O' BRIEN et al. (33) e de PENTIKÄINEN et al. (34) mostraram que biglicam e decorim, proteodermatans sulfatos, interagem e retêm as lipoproteínas na matriz extracelular da parede arterial.

Podemos então especular que a presença de dermatam sulfato na parede dos vasos sangüíneos deve ser um fator importante também na formação e desenvolvimento do processo ateromatoso nos enxertos. E, que a maior presença de dermatam sulfato na parede da veia safena resulta na sua maior susceptibilidade a ateriosclerose em relação aos enxertos arteriais.

AGRADECIMENTOS: Esta pesquisa foi apoiada por: CNPq, FAPESP e Fundação Pró-Sangue de São Paulo.

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